La miosina è la principale proteina motrice nel muscolo scheletrico, responsabile dell’idrolisi dell’adenosina trifosfato (ATP) che alimenta la contrazione muscolare. Oltre alla produzione di forza, la miosina a riposo consuma ATP in cicli futili a due velocità, di cui la più lenta è associata allo Stato Super Rilassato (SRX), in contrasto con lo Stato Rilassato Disordinato (DRX), meno inibito.
Lo SRX viene tipicamente misurato utilizzando la tecnica del mantATP chasing, in cui il decadimento di un analogo fluorescente dell’ATP viene adattato a una funzione multiesponenziale.
Recentemente, sono state sollevate importanti preoccupazioni riguardo all’uso di questa tecnica, in particolare quando applicata a preparazioni di miosina solubile. Sebbene le fibre “skinned” offrano il vantaggio di preservare la struttura nativa del filamento spesso e la cooperatività della miosina, la diffusione limitata e il legame aspecifico del mantATP pongono delle difficoltà.
In questo studio combiniamo dati sperimentali e modellizzazione in silico per analizzare i contributi delle diverse componenti nel segnale del mantATP chasing. Analizziamo fibre “skinned” di controllo e fibre sottoposte a estrazione di miosina.
La nostra analisi mostra che la componente aspecifica si sovrappone parzialmente alla scala temporale del DRX. Al contrario, la componente lenta, legata al rilascio del nucleotide da parte della miosina nello stato SRX, è caratterizzata da una costante di tempo significativamente diversa da quelle del segnale aspecifico e del DRX, permettendone una stima affidabile tramite questa tecnica.
I nostri risultati indicano che la valutazione delle componenti aspecifiche del mantATP è necessaria per ottenere una stima affidabile sia dello SRX che del DRX. Abbiamo validato la nostra analisi confrontando le popolazioni e le costanti di tempo ottenute dal chasing con mantATP con le velocità di mantATPasi in condizioni di controllo e in presenza di destabilizzazione dello SRX indotta da piperina.
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